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Jul 09, 2023

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12619 (2023) Citar este artigo

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Uma estratégia para combater a resistência antimicrobiana é a descoberta de novas classes de antibióticos. A maioria dos antibióticos irá, em algum momento, interagir com a membrana bacteriana, interferindo em sua integridade ou atravessando-a. Ferramentas confiáveis ​​e eficientes para determinar a constante de dissociação para ligação à membrana (KD) e o coeficiente de partição entre as fases aquosa e de membrana (KP) são, portanto, ferramentas importantes para descobrir e otimizar resultados antimicrobianos. Aqui demonstramos que a termoforese em microescala (MST) pode ser usada para medição de KD sem rótulo, utilizando a fluorescência intrínseca do triptofano e, assim, eliminando a necessidade de marcação com cromóforo. Como prova de princípio, usamos o método para medir a ligação de um conjunto de pequenos AMPs cíclicos a grandes vesículas unilamelares (LUVs) e dois tipos de nanodiscos lipídicos montados por ácido estireno maleico (SMA) e SMA de amônio quaternário (SMA-QA ). Os valores de KD medidos correlacionam-se bem com as medições correspondentes usando ressonância plasmônica de superfície (SPR), refletindo também amplamente a concentração mínima de inibição (MIC) dos AMPs testados em relação a S. aureus e E. coli. Concluímos que o MST é um método promissor para detecção rápida e econômica de interações peptídeo-lipídio ou mapeamento de condições de amostra em preparação para estudos mais avançados que dependem de preparo caro de amostra, rotulagem e/ou tempo de instrumento.

Os péptidos antimicrobianos (AMPs) têm atraído cada vez mais atenção como fonte de inspiração para combater a iminente crise de resistência antimicrobiana, à medida que a descoberta de novas classes de antibióticos foi interrompida1. Os AMPs são uma classe de peptídeos que possuem atividade antimicrobiana, embora também sejam conhecidos por possuírem algumas propriedades antifúngicas e anticancerígenas2,3. Eles são tipicamente peptídeos catiônicos curtos de cerca de 12 a 50 aminoácidos, com normalmente pelo menos 4 resíduos necessários para a atividade4. Encontrados na maioria dos organismos vivos, são componentes naturais e indispensáveis ​​das defesas imunitárias inatas5,6,7,8. Atualmente, mais de 20.000 sequências peptídicas com propriedades antimicrobianas estão publicadas em repositórios dedicados9,10,11,12,13, fornecendo um conjunto de potenciais candidatos terapêuticos. O modo de ação antimicrobiano da maioria dos AMPs parece ser atingir a integridade e/ou o potencial elétrico da bicamada da membrana, ou ter múltiplos alvos e combinações de modos de ação – algo que torna a resistência mais difícil de desenvolver e vem com um maior custo de aptidão para manter. Com algumas exceções, isto contrasta com os antibióticos tradicionais, que geralmente têm um alvo bem definido. Uma segunda vantagem dos AMPs é que não há necessidade de atravessar completamente a membrana, com os péptidos activos na membrana frequentemente exercendo as suas actividades rompendo, permeabilizando ou lisando a própria membrana bacteriana14,15.

A afinidade do AMP para com as membranas bacterianas é frequentemente descrita de duas maneiras: Como um evento de ligação que pode ser descrito através da constante de dissociação KD16; ou como um sistema bifásico, onde a interação do AMP com os lipídios é vista como uma partição entre uma fase lipídica e uma fase aquosa, caracterizada pela constante de partição KP17. Tanto KD como KP são, portanto, descritores úteis para a triagem de compostos com base nas suas interações com a membrana bacteriana alvo.

Os métodos atuais utilizados para avaliar a afinidade lipídica normalmente sofrem de várias desvantagens. Eles podem não ser aplicáveis ​​a ligações mais fortes (NMR) 18, exigir rotulagem que afete a ligação (ensaios de fluorescência) 19, ser demorados (NMR e SPR) 20,21, exigir grandes quantidades de amostras (NMR) ou exigir ajuste fino para cada composto individual (SPR e ITC)20,21. A termoforese em microescala (MST) é um método que não apresenta essas desvantagens22. É uma ferramenta simples mas poderosa, que permite a determinação dos parâmetros de ligação através da observação dos efeitos da ligação num fluoróforo e nas propriedades termoforéticas relativas dos complexos formados. As ligações são obtidas monitorando alterações na intensidade de fluorescência de um complexo ao longo do tempo após exposição a um laser IR. O laser aquece uma série de amostras com diferentes concentrações de ligantes, causando uma redistribuição das moléculas de acordo com suas energias relativas de Gibbs em solução em diferentes temperaturas (termoforese). Alterações na fluorescência devido aos efeitos de ligação do ligante são monitoradas após aquecimento e re-resfriamento. O método é sensível a mudanças na dobra, forma, camada de solvatação, carga ou tamanho geral do complexo ligado ao ligante. Essas alterações podem afetar o ambiente local de um fluoróforo, alterando a têmpera dinâmica e estática, bem como as propriedades termoforéticas do complexo, e tornar o MST sensível a alterações potencialmente menores nas propriedades que surgem da ligação . Atualmente, o MST é usado principalmente para avaliar interações biomoleculares, incluindo a ligação de ligantes a vários substratos22 e polimerização24. Uma aplicação anterior relacionada do MST por Yu et al. avaliaram a ligação de um AMP usando marcação com FITC. O MST pode ser realizado usando marcação com fluoróforo ou sem rótulo, aproveitando aminoácidos intrinsecamente fluorescentes como W, Y e F. A quase onipresença de W em muitos AMPs oferece uma oportunidade de estudar diretamente as propriedades de ligação de AMP, utilizando a fluorescência intrínseca de W Outras vantagens importantes do MST são os baixos requisitos de amostra, tempos de medição curtos e configuração experimental simples20,21,26.